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            IHC

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            免疫組化常見問題原因分析

            問題

            可能原因

            驗證或解決辦法

             

             

             

             

             

             

             

             

            無染色

            一抗和二抗不匹配

            使用針對一抗的二抗(如一抗來自兔,二抗為抗兔抗體)

            沒有足夠的一抗與目標蛋白結合

            使用低稀釋度抗體。延長4℃孵育時間(如過夜)。

            抗體的天然結構(3D形態)受損不適用于IHC

            用天然(非變性的)WB法檢測抗體,確??贵w沒被損壞。

            由于不當儲存、稀釋或反復凍融造成一抗/二抗試劑盒失效

            做陽性對照確認一抗/二抗試劑盒的有效性。

            靶組織中沒有目標蛋白

            參照抗體供應商的建議做陽性對照。

            組織中沒有足夠的目標蛋白

            應用信號放大操作。

            沒有避光保存二抗

            避免將二抗處于光照下

            脫蠟不徹底

            延長脫蠟時間,更換二甲苯。

            固定步驟(使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑)修飾了抗體識別表位

            抗原修復法暴露出抗原表位,縮短固定時間。

            蛋白位于細胞核內(核蛋白),抗體不能穿透核膜

            在封閉液和抗體稀釋液中加入通透劑。

            PBS緩沖液被細菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根

            在抗體PBS儲存液中加入0.01%疊氮化合物,或使用新鮮無菌的PBS。

             

             

             

             

             

             

             

             

            高背景

            沒有封閉非特異性結合或封閉不充分

            延長封閉時間,并考慮改換封閉劑。建議用10%正常血清封閉切片1小時或1-5% BSA封閉培養細胞30分鐘。

            一抗濃度過高

            滴定法尋找到最佳抗體濃度,或在濃度較低抗體中延長孵育時間(最好是緩慢而準確地結合)。

            孵育溫度過高

            4°C孵育切片或細胞。

            二抗發生了非特異性結合(被損壞)

            不加一抗,做二抗對照。

            組織沖洗不徹底,有固定劑殘留

            所有步驟都要用PBS充分洗滌。

            存在內源性過氧化物酶活性

            用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑(2mM),或抑制過氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

            固定過度(固定劑用福爾馬林和多聚甲醛)導致抗體識別抗原位點被修飾

            改變抗原修復方法,縮短與抗原修復液的孵育時間。

            信號過度放大(信號放大技術)

            縮短信號放大孵育時間,稀釋信號擴大試劑盒。

            染料與PBS在細胞/組織中相互作用(酶檢測法)

            用Tris緩沖液沖洗切片后,再與底物孵育。孵育后,Tris緩沖液再次沖洗細胞/切片。

            通透作用破壞膜并除去了膜蛋白

            去除緩沖液中的通透劑

            底物過量(酶檢測法)

            縮短底物孵育時間

             

             

             

            非特異性染色

            一抗/二抗濃度過高

            降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對比不表達目標蛋白細胞的信號強度。

            存在內源性過氧化物酶活性

            用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑(2mM),或抑制過氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

            一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測鼠組織),加二抗后,二抗會與同源的所有組織結合

            應用與組織非同源的一抗

            切片/細胞變干

            保持切片/細胞濕度,切勿變干。

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